Perbedaan Kunci - Blotting Utara vs Selatan vs Barat
 

Deteksi urutan spesifik DNA, RNA, dan protein sangat penting untuk berbagai jenis studi dalam biologi molekuler. Elektroforesis gel merupakan teknik pemisahan DNA, RNA, dan protein berdasarkan ukurannya. Dari profil gel, urutan DNA tertentu, urutan RNA, atau protein dideteksi dengan teknik khusus yang disebut blotting dan hibridisasi dengan probe berlabel. Ada tiga jenis metode blotting yang berbeda yaitu selatan, utara dan barat. Perbedaan utama antara blotting utara selatan dan barat terletak pada jenis molekul yang dideteksi dari sampel. Southern blotting adalah metode yang mendeteksi urutan DNA tertentu dari sampel DNA. Northern blotting adalah teknik yang mendeteksi urutan RNA tertentu dari sampel RNA. Western blotting adalah metode yang mendeteksi protein tertentu dari sampel protein.

ISI
1. Ikhtisar dan Perbedaan Utama
2. Apa itu Southern Blotting?
3. Apa itu Blotting Utara?
4. Apa itu Western Blotting?
5. Perbandingan Berdampingan – Blotting Utara vs Selatan vs Barat
6. Ringkasan

Apa itu Southern Blotting?

Teknik blotting selatan dikembangkan oleh EM Southern pada tahun 1975 untuk identifikasi urutan DNA spesifik dari sampel DNA. Ini adalah teknik blotting pertama yang diperkenalkan dalam biologi molekuler. Ini memungkinkan deteksi gen spesifik dari DNA, fragmen spesifik dari DNA, dll. Ada beberapa langkah yang terlibat dalam teknik blotting selatan. Mereka adalah sebagai berikut.

1. DNA diisolasi dari sampel dan dicerna dengan endonuklease restriksi .
2. Sampel dicerna dipisahkan oleh Agarose gel elektroforesis.
3. Fragmen DNA dalam gel didenaturasi menjadi untai tunggal dengan menggunakan larutan basa.
4. DNA untai tunggal ditransfer ke membran filter nitroselulosa melalui transfer kapiler.
5. DNA yang ditransfer difiksasi ke membran secara permanen.
6. DNA tetap pada membran dihibridisasi dengan probe berlabel.
7. DNA yang tidak terikat dicuci dari membran dengan mencuci.
8. Film sinar-X diekspos ke membran dan autoradiograf disiapkan.

Southern blotting diterapkan untuk berbagai aspek biologi molekuler. Ini berguna dalam pemetaan RFLP , studi forensik, metilasi DNA dalam ekspresi gen , deteksi gen yang bermutasi pada kelainan genetik, sidik jari DNA, dll.

Gambar 01: Teknik Southern Blotting

Apa itu Blotting Utara?

Northern blotting adalah metode yang dirancang untuk mendeteksi urutan RNA tertentu atau urutan mRNA dari sampel untuk mempelajari ekspresi gen. Teknik ini dikembangkan oleh Alwine, Kemp, dan Stark pada tahun 1979. Teknik ini berbeda dengan teknik sourthern dan western blotting karena beberapa langkah. Namun, teknik ini juga dilakukan melalui elektroforesis gel, blotting, dan hibridisasi dengan probe dan deteksi berlabel spesifik. Teknik blotting utara dilakukan sebagai berikut.

1. RNA diekstraksi dari sampel dan dipisahkan dengan elektroforesis gel.
2. RNA ditransfer dari gel ke membran blotting dan difiksasi.
3. Membran diperlakukan dengan probe berlabel yang dibuat dari cDNA atau RNA (probe melengkapi urutan tertentu dalam sampel).
4. Probe diinkubasi dengan membran untuk mengikat dengan urutan tertentu.
5. Probe yang tidak terikat dicuci.
6. Fragmen hibridisasi dideteksi oleh autoradiograf.

Northern blotting adalah alat penting dalam deteksi dan kuantifikasi mRNA hibridisasi, mempelajari degradasi RNA, evaluasi waktu paruh RNA, deteksi penyambungan RNA, mempelajari ekspresi gen, dll.

Gambar 02: Blotting Utara

Apa itu Western Blotting?

Western blotting adalah metode untuk mendeteksi protein tertentu dari campuran protein dengan menggunakan antibodi berlabel. Oleh karena itu, western blot juga dikenal sebagai immunoblot . Teknik ini diperkenalkan oleh Towbin et al pada tahun 1979 dan sekarang secara rutin dilakukan di laboratorium untuk analisis protein. Langkah-langkahnya adalah sebagai berikut.

1. Protein diekstraksi dari sampel
2. Protein dipisahkan berdasarkan ukurannya menggunakan elektroforesis gel poliakrilamida
3. Molekul yang terpisah ditransfer ke membran PVDF atau membran nitroselulosa dengan elektroporasi
4. Membran diblokir untuk pengikatan nonspesifik dengan antibodi
5. Protein yang ditransfer terikat dengan antibodi primer (antibodi berlabel enzim).
6. Membran dicuci untuk menghilangkan antibodi primer yang tidak terikat secara spesifik
7. Antibodi terikat dideteksi dengan menambahkan substrat dan mendeteksi endapan berwarna yang terbentuk

Western blotting berguna dalam mendeteksi antibodi anti-HIV dalam sampel serum manusia. Western blot juga dapat digunakan sebagai tes konfirmasi untuk infeksi Hepatitis B dan tes definitif untuk penyakit sapi gila.

Gambar 03: Western Blotting

Apa perbedaan antara Northern Southern dan Western Blotting?

Ringkasan – Blotting Utara vs Selatan vs Barat

Blotting adalah teknik khusus yang dikembangkan untuk identifikasi DNA, RNA, atau protein spesifik dari sampel. Ada tiga prosedur blotting terpisah, yaitu utara, selatan dan barat, untuk mendeteksi jenis molekul tertentu. Teknik Northern blotting dirancang untuk mendeteksi urutan RNA tertentu dari campuran RNA. Teknik blotting selatan memungkinkan deteksi urutan DNA spesifik dari sampel DNA dan teknik western blotting dikembangkan untuk mengidentifikasi protein spesifik dari campuran protein.

Referensi
1. Owa, Janay. “Western Blot: Ikhtisar Transfer Protein.” Jurnal Ilmu Kedokteran Amerika Utara. Medknow Publications & Media Pvt Ltd, Maret 2014. Web. 27 Maret 2017
2. Brown, T. "Blotting Selatan." Protokol saat ini dalam imunologi. Perpustakaan Kedokteran Nasional AS, Mei 2001. Web. 27 Maret 2017
3. Dia, Shan L. “Bercak Utara.” Metode dalam enzimologi. Perpustakaan Kedokteran Nasional AS, 2013. Web. 27 Maret 2017

Gambar Courtesy:
1. "Skema Blot Utara" Oleh RNA405 - Karya sendiri (Domain Publik) melalui Commons Wikimedia
2. "Western blot 114A" Oleh Amanthabagdon - Karya sendiri (Domain Publik) melalui Commons Wikimedia

Posting terkait:

Perbedaan Antara Elisa dan Western Blot Perbedaan Antara Afinitas dan Aviditas Perbedaan Antara Kode Genetik dan Kodon Perbedaan Antara Transfeksi dan Transduksi Perbedaan Antara Transfeksi Transien dan Stabil